Набор реагентов «Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens-РВ»
Кат. № PH-038
Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens является аэробной, грамм положительной, подвижной бактерией, с одним-тремя боковыми или полярными жгутиками. Данная бактерия является возбудителем ржаво-бурой пятнистости листьев фасоли (бактериального увядания фасоли). На картофельном агаре на 3-4 сутки образуют светло-желтые, круглые, гладкие, плоские или слегка выпуклые, маслянистые колонии.
Возбудитель ржаво-бурой пятнистости листьев фасоли C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens был включен Европейской и Средиземноморской организацией по карантину и защите растений (ЕОКЗР) в Список А2 карантинных объектов (https://www.eppo.int) (PM1/002(28) (PM 7/102 (1)). Карибская комиссия по карантину и защите растений и Межафриканский совет по фитосанитарии также относят возбудителя ржаво-бурой пятнистости листьев фасоли к карантинным видам.
Основными и наиболее восприимчивыми к ржаво-бурой пятнистости листьев фасоли (бактериальному заболеванию сои) хозяевами являются растения рода Phaseolus spp., в особенности фасоль обыкновенная Phaseolus vulgaris, фасоль огненно-красная P. coccineus, фасоль луновидная P. lunatus, горох обыкновенный Pisum sativum, вигна угловатая (адзуки) Vigna angularis, маш (бобы мунг) V. radiata, черный маш (урд) V. mungo, коровий горох V. unguiculata, соя культурная Glycine max, лобия Lablab purpureus. Большинство культурных и диких форм вышеперечисленных растений широко распространено на территории России.
Бактерия C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens очень устойчива к неблагоприятным условиям окружающей среды и может сохранять жизнеспособность внутри семян в течении 24 лет. Информации о переносчиках данного возбудителя отсутствует, но известно, что нематода Eloidogyne incognita может способствовать проникновению патогена через рану.
C. flaccumfaciens pv. flaccumfaciens поражает сосудистую систему, вызывает увядание и гибель всходов и взрослых растений. Обычно больные растения плохо растут и становятся карликовыми, у них опадают листья, отмирают побеги и ломается стебель. Семена сои, зараженные этим патогеном, являются источником распространения инфекции.
Отбор образцов для диагностики на наличие возбудителя ржаво-бурой пятнистости листьев фасоли проводится согласно указаниям European and Mediterranean Plant Protection Organization PM 7/102 (1).
Для выявления и подтверждения бактериальной инфекции проводят выделение бактерий в чистую культуру и их лабораторное определение; используют биохимические тесты, современные методы серологической и молекулярной диагностики, такие как иммунофлуоресцентный метод (ИФ), метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА) и другие. Для проведения ИФ используют бактериальную суспензию 106 КОЕ/мл, что описано в стандарте ЕОКЗР РМ 7/97 (https://www.eppo.int). Протоколы для проведения анализа с помощью ПЦР, разработанные Tegli et al. (2002) и Guimaraes et al. (2001), описаны в диагностическом протоколе ЕОКЗР РМ 7/102 (https://www.eppo.int).
«ФИТОСКРИН» — технология быстрой молекулярно-генетической диагностики заболеваний растений методом ПЦР в реальном времени
«Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens-РВ»
Набор реагентов для выявления ДНК Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens возбудителя ржаво-бурой пятнистости листьев фасоли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ)
Обнаружение специфических фрагментов ДНК Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens основано на использовании метода мультиплексной полимеразной цепной реакции с получением результата в режиме реального времени — ПЦР-РВ.
Набор реагентов «Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный для Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens фрагмент генома (по каналу флуоресценции FAM/Green, а также внутренний положительный контроль – по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow. Праймеры, применяемые в данной системе, сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать 100% всех штаммов целевой бактерии последовательности которых находились в базе данных NCBI Nucleotide на 15.08.2019 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Вторая реакция — ВПК (Внутреннего Положительного Контроля) — необходима для исключения ложноотрицательных результатов.
- Чувствительность
Чувствительность ПЦР при использовании набора реагентов «Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens-РВ» не менее 2,0*103 копий ДНК в миллилитре пробы.
- Специфичность
При проверке на специфичность использовалось ДНК близкородственных, сопутствующих и целевых видов микроорганизмов следующих коллекций: Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ), CIRM-Plant Associated Bacteria / CIRM-CFBP, Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH.
Специфичность — ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих ДНК целевой бактерии, отсутствовали, ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и ДНК бактерий, не содержащих вышеперечисленные специфические фрагменты, отсутствовали.
Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия).
