Набор реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ»
Кат. № PH-034
Вирус штриховатой мозаики ячменя (Barley stripe mosaic virus - BSMV), типичный и наиболее изученный представитель группы Hordeiviruses, поражающий зерновые культуры, представляет собой палочкообразный РНК-содержащий вирус с многокомпонентным геномом.
Все геномные РНК BSMV несут на З'-конце тРНК-подобную структуру, способную акцептировать тирозин и внутренний ро1у(А)-блок разной длины. Капсид BSMV построен из идентичных белковых субъединиц, расположенных по спирали. Белок оболочки BSMV, ген которого локализован на 5'-концевом участке одной из геномных РНК (РНК2а), является гликопротеином и способен к реполимеризации с образованием стабильных промежуточных белковых агрегатов, а также может инкапсулировать чужеродную РНК. BSMV способен индуцировать мутации в растении-хозяине.
Согласно литературным данным, вирус штриховатой мозаики ячменя широко распространен во всем мире. Его естественные хозяева — пшеница (Triticum aestivum), ячмень (Hordeum vulgare), овес (Avena sativa), кукуруза (Zea mays), однако она до сих пор не была включена в список характерных хозяев этого вируса. В США и Канаде BSMV давно классифицирован как карантинный объект, поскольку патоген передается через посевной материал. В 2016 г. был включен Европейско-Средиземноморской организацией по карантину и защите растений (ЕОКЗР) в Список А2 (PM1 / 002 (28) карантинных объектов (https://www.eppo.int) (PM3 / 034 (1)), (PM3 / 078 (1)).
По данным лаборатории вирусологии ФНЦ Биоразнообразия ДВО РАН BSMV широко распространен на территории Приморского края. Даже в благополучные в эпидемиологическом отношении годы его встречаемость в рядовых посевах яровой пшеницы и ярового ячменя достигает 3%. В условиях этого региона озимые зерновые культуры более чувствительны к инфекции, чем яровые.
Проявление симптомов на зараженных растениях зависит от штамма вируса, сорта растения-хозяина и факторов окружающей среды. Проявление симптомов усиливается при повышении температуры (24-30 °C).
В зависимости от штамма вируса симптомы могут изменяться от небольших полос, покрывающих всю поверхность листа, до удлиненных полос. У ячменя симптомы, вызываемые легкими штаммами BSMV, почти не видны. Симптомы у различных сортов-хозяев могут варьировать от светло-зеленых или хлоротичных полос до хлороза и некроза. Семена растений, зараженных BSMV, мелкие и сморщенные.
Отбор образцов для диагностики на наличие РНК вируса штриховатой мозаики ячменя проводится согласно указаниям ГОСТ 13586.3-2015 Зерно. Правила приемки и методы отбора проб (с Поправкой) и EPPO Standards PM3/034(1) Barley stripe mosaic hordeivirus. Inspection and test methods for barley seeds.
«ФИТОСКРИН» — технология быстрой молекулярно-генетической диагностики заболеваний растений методом ПЦР в реальном времени
«Barley stripe mosaic virus-РВ»
Набор реагентов для обнаружения РНК вируса штриховатой мозаики ячменя методом полимеразной цепной реакции в реальном времени совмещенной с реакцией обратной транскрипции (ОТ-ПЦР-РВ)
Набор реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» предназначен для обнаружения РНК вируса жёлтой карликовости ячменя. Набор может быть использован в лабораторных центрах и институтах, проводящих контроль фитосанитарного состояния растений, в том числе посадочного материала в целях обнаружения РНК Barley stripe mosaic virus. Набор позволяет качественно определить, содержится ли в образце РНК Barley stripe mosaic virus.
Диагностика растений на вирус ячменя с помощью набора «Barley stripe mosaic virus-РВ» возможна на всех этапах его вегетационного развития методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Проведение реакции обратной транскрипции и последующей мультиплексной ПЦР-РВ в наборе реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» осуществляется последовательно в одной пробирке в течение одного запуска амплификатора без каких-либо дополнительных манипуляций.
Набор реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» позволяет одновременно выявлять в одной реакционной смеси специфичный фрагменты гена белка оболочки (cp) вируса жёлтой карликовости ячменя – по каналу флуоресценции ROX/Orange, а также внутренний положительный контроль – по каналу флуоресценции R6G/HEX/Yellow.
Праймеры, применяемые в данной системе, сконструированы таким образом, чтобы обнаруживать 100% целевых вирусов последовательности которых находились в базе данных NCBI Nucleotide на 10.06.2019 (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Вторая реакция – ВПК (Внутреннего Положительного Контроля) – необходима для исключения ложноотрицательных результатов.
- Чувствительность
Для испытания аналитической чувствительности набора был произведен ряд из 8-ми десятикратных разведений полученной РНК изолятов PV-0330 Barley stripe mosaic virus средней зараженности (16,4 ct). Положительная реакция наблюдалась при разведении исходного инокулюма в 106 раза. При разведении в 107 реакция была нестабильной. При разведении в 108 раз специфичной реакции не отмечено.
Чувствительность ПЦР при использовании набора реагентов «Barley stripe mosaic virus-РВ» не менее 3,0*103 копий кДНК в миллилитре пробы.
- Специфичность
При проверке на специфичность использовалось РНК близкородственных, сопутствующих и целевых штаммов вирусов следующих коллекций: DSMZ, Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»).
Ложноотрицательные результаты при анализе образцов растений, содержащих РНК целевых вирусов, отсутствовали, ложноположительные результаты при анализе образцов ДНК растений и РНК вирусов, не содержащих вышеперечисленные специфические фрагменты, отсутствовали.
Набор реагентов апробирован на следующих приборах: «АНК-32 (32М, 48)» (ИАП РАН, г. Санкт-Петербург, Россия), «CFX-96» («BioRad», США), «Rotor Gene» (Qiagen), «DT» («ДНК-технология», Россия).
